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生物素標記試劑的合成方法改進及其在DNA合成中的應用

             生物素標記試劑的合成方法改進及其在DNA合成中的應用
                                   楊明蓉1,2,唐卓2,陳應春1
    (1.四川大學華西藥學院,四川成都610041;2.中國科學院成都生物研究所,四川成都610041)
    摘要:以生物素,4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷,6-氨基-1-己醇,2-氰基乙氧基-雙(N,N-二異丙基)亞磷酰胺等為原料,采用改進方法合成了生物素標記試劑———[1-N-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-生物素-6-氨基己基]-2-氰乙氧基-N,N-二異丙基亞磷酰胺(3),總收率51.0%,其結構經1H NMR,13 C NMR,31 P NMR和MS確證。通過固相亞磷酰胺三酯法,應用3合成了一段含有十個堿基的5’-端生物素標記的寡核苷酸鏈,其結構經MS確證。
    關鍵詞:生物素;標記;固相亞磷酰胺三酯法;DNA合成
    中圖分類號:O626;O627.51文獻標識碼:A文章編號:1005-1511(2012)03-0331-03
    近年來,核酸探針雜交技術在醫療科研和臨床中被廣泛采用,成為一項直接檢查病原體、癌基因、遺傳病基因突變等的重要手段。用于雜交的核酸探針必須先進行標記,可分為同位素標記和非同位素標記兩大類。生物素標記的核酸探針屬于非同位素標記,它是利用親和素對生物素有極高親和力的原理,分子雜交后用親和素或鏈霉親和素進行檢測[1~4]。生物素標記探針穩定,不失活,并能配用多種檢測系統,簡單方便。
    Richard T Pon[5]設計合成了一種較為理想的生物素標記試劑———[1-N-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)-生物素-6-氨基己基]-2-氰乙氧基-N,N-二異丙基亞磷酰胺(3)。3所含的6-氨基己基側鏈顯著增加了生物敏感性[6],同時3中的二甲氧三苯基增加了穩定性,不僅有利于寡核苷酸鏈的合成與純化,而且還可以在DNA合成儀上通過顏色變化檢測連接效率。
    為了推進3的應用,本文改進文獻[5]方法,先將生物素與DMTrCl(4,4’-二甲氧基三苯基氯甲烷)反應制得1-N-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)生物素(1);1與6-氨基-1-己醇在氯甲酸乙酯中縮合制得1-N-(4,4’-二甲氧基三苯甲基)生物素-6-氨基己醇(2);2與磷試劑2-氰乙氧基-雙(N,N-二異丙基)亞磷酰胺(Ⅰ)[7]反應合成了3(Scheme1),總收率51.0%,其結構經1H NMR,13 C NMR,31P NMR和MS確證。

    改進方法將文獻[5]路線由5步簡化為3步,提高了生物素的轉化率,同時避免了昂貴的硅試劑及TBAF(四丁基氟化銨)的使用。
    為了驗證改進方法的可行性,本文還采用固相亞磷胺三酯法,應用3合成了一段含有十個堿基的5’-端Biotin標記的寡核苷酸鏈Biotin-A-A-A-A-A-A-A-A-A-A(記為Biotin-A10)[8~11],其結構經MS確證。
    1·實驗部分
    1.1儀器與試劑
    Yanaco型顯微熔點儀(溫度計未校正);Brucker-600 MHz型核磁共振儀(CDCl3為溶劑,TMS為內標);Alltech HPLC 1500型液相色譜儀(HPLC);Bruker Daltonics ESI-Bio TOF-Q型高分辨質譜儀;ABI 394型DNA合成儀。
    硅膠300目~400目,其余所用試劑均為分析純;反應均在無水條件下進行,所用試劑都需作無水處理。
    1.2合成
    (1)1的合成在反應瓶中依次加入生物素2 g(8.2 mmol)的吡啶(40 mL)溶液,DMTrCl 8.32 g(24.6mmol),Et3N 828 mg(8.2 mmol)和DMAP(4-二甲氨基吡啶)250.4 mg(2.08 mmol),攪拌下于70℃反應4 h。濃縮后用氯仿稀釋,分液,有機相用5%檸檬酸鈉溶液洗滌三次,無水硫酸鈉干燥,濃縮后經硅膠柱層析[洗脫劑:V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=3∶97]純化得橙紅色固體1 3.36 g,收率75.0%;1H NMR(DMSO-d6)δ:1.43~1.64(m,6H,CH2),2.16~2.19(m,4H,SCH2,COCH2),3.11(m,1H,SCH),3.72(s,6H,OCH3),4.27~4.33(m,2H,NCH),6.70(s,1H,NH),6.84(d,4H,ArH),7.22(m,9H,ArH),11.94(s,1H,CO2H)。
    (2)2的合成
    在圓底燒瓶中加入1 1.65 g(3.02 mmol)的THF(16 mL)溶液和Et3N 306 mg(3.02 mmol),攪拌下于0℃緩慢滴加氯甲酸乙酯654 mg(6.04mmol),滴畢,反應1 h;冷卻至-20℃,加入6-氨基-1-己醇608 mg(6.04 mmol),反應過夜。加水稀釋后用氯仿(3×100 mL)萃取,合并萃取液,用無水硫酸鈉干燥,濃縮后經硅膠柱層析[洗脫劑:V(甲醇)∶V(二氯甲烷)=1∶20]純化得白色固體2 1.56 g,收率79.3%;1H NMRδ:1.24~1.70(m,14H,CH2),2.15(t,2H,NCH2),2.25~2.60(m,2H,COCH2),3.08~3.23(m,3H,CHS),3.60(t,2H,OCH2),3.80(s,6H,OCH3),4.36(m,2H,NCH),5.10(s,1H,NH),5.63(s,1H,NH),6.81(d,4H,ArH),7.22(m,9H,ArH)。
    (3)3的合成
    在反應瓶中依次加入2 645 mg(1 mmol)的無水乙腈(10 mL)溶液,四氮唑140 mg(2 mmol),DIPA(N,N-二異丙胺)242.3 mg(2.4 mmol)和Ⅰ600 mg(2 mmol),攪拌下于室溫反應2 h。用二氯甲烷(200 mL)稀釋,分液,有機相依次用5%碳酸氫鈉溶液和飽和食鹽水洗滌,無水硫酸鈉干燥,濃縮后經硅膠柱層析[洗脫劑:V(Et3N)∶V(氯仿)=1∶19]純化得白色固體3 724 mg,收率85.7%,m.p.148℃~150℃;1H NMRδ:1.21(m,12H,CH3),1.24~1.90(m,14H,CH2),2.17(t,2H,NCH2),2.22~2.60(m,2H,COCH2),2.65(t,2H,CH2CN),3.08~3.30(m,3H,CHS),3.53~3.78(m,4H,OCH2),3.80(s,6H,OCH3),4.35(m,2H,CHN),5.13(s,1H,NH),5.61(s,1H,NH),6.81(d,4H,ArH),7.22(m,9H,ArH);13C NMRδ:11.44,24.55,24.60,24.66,25.23,25.61,26.63,29.50,39.31,42.96,43.01,46.20,54.41,55.23,58.20,59.66,65.40,72.74,112.79,117.77,126.86,127.48,129.74,131.30,135.83,135.91,143.86,158.39,161.81,172.92;31P NMRδ:147.81(s);ESI-MS m/z:868{[M+Na]+}。
    1.3 3在合成DNA中的應用
    在反應瓶中加入0.1 mol·L-13的乙腈溶液,置DNA合成儀上,在一段含10個A堿基的寡核苷酸鏈(A10)的5’-端連接3;其N-DMT(N-上的4,4’-二甲基三苯基甲基保護基)經5%三氯乙酸/二氯甲烷脫去后于55℃氨解10 h。經反相HPLC純化(條件見表1)得目標序列Biotin-A10;ESI-MS m/z:3 474。
             
    2·結果與討論
    本文以文獻[5]工作為基礎,改進合成3的方法。由1合成2采用混合酸酐法,利用氨基與羥基反應活性的差異一步生成酰胺,避免了羥基的保護與脫保護,簡化了反應步驟。
    由2合成3選用Ⅰ為磷試劑比2-氰基乙氧基-N,N-二異丙基氯代亞磷酰胺(Ⅱ)[5]的穩定性更好、后處理方便、且原料轉化率高,3總收率達51.0%。此外,Ⅰ可大量合成,相對于昂貴的Ⅱ成本大大降低,有利于工業化生產。
    本文將3應用于合成DNA,成功地制得Bio-tin-A10,充分顯示了3在合成DNA中的廣闊應用前景。
    為了提高生物素的轉化率,DMTrCl,6-氨基-1-己醇,Ⅰ均要過量;因為Ⅰ易被氧化,由2合成3應在氮氣保護下進行。
    參考文獻:略


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